农药标准物质

农药分析测定，绝大多数是借助于大型精密仪器实现的。这些定量方法通常为比较法，即用农药标准物质校准分析仪器，以其峰面积或峰高值为基准来计算出样品中某种农药的含量。因此，农药标准物质是开展农药分析工作的先决条件，也是测定结果准确与否的质量保证。

农药标准物质既然是一个基准尺度，分析工作者对它的要求就非常严格。如果它不符合要求，就会在分析检测过程中将不准确的信息传递到被测定的样品中去。本来农药质量或残留量不超标的样品，由于农药标准物质标定值偏低，最后的检验结果可能是不合格，反之亦然。所以从这一点讲农药标准物质不在于纯度有多么高，而在于它的标定值必须准确无误，且在多组分残留分析时无干扰组分。

农药标准物质在农药分析中的主要作用包括日常校准，确定分析仪器系统的工作状态，进而出具检测报告或数据；用于添加到样品中进行内部质控；用于测定方法的建立或验证已有方法。另外，对于第三方有资质质检机构必须采用有证农药标准物质，才能开展农药残留的检验工作，并依据相关标准中规定的限量值进行判定。

农药标准物质来源于农药纯品。农药纯品一般只能用于教学、科学研究、方法的建立等，而不能用于开展执法性质的农残检验工作和对样品中农药残留检验项目的仲裁工作。农药标准物质是实现农药残留准确一致的测定、保证量值传递的计量标准。采用标准物质开展检验工作还可以保证测定结果的可比性，达到量值的统一。

一  概 述

（1）定义和等级 美国于1906年就对标准物质开展了研究和应用，先后采用Standard Sample, Standard Material和Standard Reference Material(SRM)三个名称。国际标准化组织（ISO）、国际法制计量组织（OIML）、国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）和世界卫生组织（WHO）等国际组织经过反复协商，1981年正式确定了国际公认的名称：标准物质和有证标准物质。我国目前在有关法规中也明确采用这一名称。

标准物质（Reference Material, RM）：已确定其一种或几种特性值，用于校准测量器具、评价测量方法或确定材料特性量值的物质。标准物质一般分为两级：

一级标准物质（Primary Reference Material, PRM）：采用绝对测量方法或其他准确、可靠的方法测量标准物质的特性量值，其测量准确度达到国内最高水平的有证标准物质。该标准物质由国务院计量行政部门批准、颁布并授权生产。

一级标准物质通常用于描述该种农药的理化常数。一级标准物质的均匀性、稳定性良好。它在溯源链中起着承上启下的作用，许多二级标准物质是通过一级标准物质溯源至国家基准的。在只有一种定值方法的情况下，一级标准物质定值过去也采用多个实验室以同种准确可靠的方法定值。目前，国际公认的化学测量方法有精密库仑法、同位素稀释质谱法，重量法、容量法、凝固点下降法等。一级标准物质的稳定性在1年以上或达到国际上同类标准物质的先进水平。在包装形式上应符合一级标准物质技术规范的要求。一级标准物质价格昂贵，一般不用于日常农药残留测定工作。

二级标准物质（Secondary RM或 Working Standard）：采用准确、可靠的方法或直接与一级标准物质相比较的方法测量标准物质的特性量值，测量准确度满足现场测量的需要并附有证书的标准物质，该标准物质经国家有关业务主管部门批准并授权生产。

二级标准物质是在日常分析检测中大量采用的一类标准物质。二级标准物质通常是国际农药分析协作委员会（CIPAC）定义的工作标样，许多工作标样，可以直接应用原药或稍加纯化。

不论是一级标准物质还是二级标准物质均为有证标准物质。有证标准物质(Certified Reference Material，CRM)：附有证书的标准物质。其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的用于表示该特性值的计量单位，而且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。

有证标准物质一般成批制备，其特性值是通过对整批物质的样品进行测量而确定，并具有规定的不确定度。目前，国家对标准物质的研制提出了明确的技术要求，如JJF 1342-2012 标准物质研制（生产）机构通用技术要求、 JJF 1343-2012 标准物质定值的通用原则及统计学原理等。 

农药标准物质还可细分为纯度标准物质和溶液标准物质（亦称标准溶液）。由于纯度标准物质昂贵，使用时还要称量、稀释（合适溶解度的单一溶剂或混合溶剂）、定容。考虑到分析成本，农药残留检测工作经常使用溶液标准物质，包括混合溶液标准物质。溶液标准物应来源于纯度标准物质。无论是国内或国外，关于农药标准物质的术语内涵和理解还是有所不同的。我国农药残留分析工作者也习惯将农药标准物质俗称为农药“标样”或农药“标准品”或农药“纯品”。但它们之间的差异关键是看其用途，是否有证书和批准号。

（2）基本要求

① 含量。纯度一般应达到99 %以上。一级标准物质应定值到小数点后两位。工作标样为小数点后一位。工作标样的纯度可以低于99 %，但定值要准确可靠，无干扰物。在均匀性方面还必须按照均匀性检验程序分析并检测合格。

② 物理常数。像熔点、折光率等一类的物理常数应符合权威文献报导。

③ 溶液。用相应溶剂溶解时，溶液应该是澄清的。

④ 薄层层析鉴定。用合适的吸附剂，两种展开条件，显色后均为单点。

⑤ 经过气相色谱或液相色谱鉴定。用两种不同极性色谱柱或两种不同的流动相测定，扣除溶剂峰，面积归一化后杂质的含量应低于1 %。

⑥ 红外吸收光谱鉴定与标准图谱比较应一致。

⑦ 质谱鉴定。不论是气质联用还是液质联用，应该与标准谱库中相对应的农药质谱图有较高的相似度或通过对裂解的离子碎片进行解析，裂解机理合理。

（3）来源与合法性 制备和定值农药标准物质是一项耗时多、技术要求高的工作。只能由具有良好装备、丰富经验的专业人员，并且得到有关方面认可的实验室来承担。中国的农药标准物质研究工作还满足不了市场和实际工作的需求。目前中国国内自行研制生产的农药标准物质数量十分有限。国内能够提供农药标准物质（含溶液标准样品）或纯品的单位主要有中国计量科学研究院化学所（原国家标准物质研究中心）（http://www.ncrm.org.cn），出售160种以上农药标准物质及溶液；中国标准化协会标准样品工作部（http://www.china-cas.org），出售约170种农药残留分析用溶液标准样品。一些农药纯品或标准物质、溶液或杂质、降解代谢物可以从农药研究机构、大学、农药公司、化学试剂公司获得。主要的化学试剂公司，如德国默克公司（Merck），原Sigma-Aldrich公司（https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland.html）（支持结构式检索）、美国Chemservice公司 (http://www.chemservice.com)经销2300种以上农药和降解代谢物以及用于EPA各种标准分析方法的混合溶液、百灵威科技网站（https://www.jkchemical.com）等。国际标准物质信息库 COMAR（http://www.comar.bam.de/en/）提供世界各国农药一级标准物质的信息，查询到相应信息后，直接联系供应商。农药公司在中国境内进行农药注册登记的所用纯品或降解代谢物，通常由各公司提供。

对相应农药品种或有关化合物在上述英文网站检索时，最有效的搜索关键词是化学文摘登录号。用化学名称检索成功率较低。如何获得化学文摘登录号，一是查询有关网站，如农药名网等；二是知道该化合物的化学结构式，利用化学结构式，去SciFinder（收费）查询检索，确认该化合物唯一的化学文摘登录号。对于一些新农药及降解、代谢物存在着还没有著录分配化学文摘登录号的情况。 

（4）标签 标签是农药一级标准物质、二级标准物质的合格证书，图1为一张二级标准物质的合格证书样例。有证农药标准物质的标签格式和内容应符合国家有关规定和要求。

图1 农药二级标准物质证书样例

（5）包装和贮藏 大批量的农药标准物质应该及时分装，分装后可避免二次污染。液体的样品可以采用安培瓶分装。固体农药包装最好采用小体积的带有合适内盖（通常有锡箔纸或聚四氟乙烯内衬）和螺纹外帽，开启后能重新盖好的小玻璃瓶。玻璃瓶的容量一般为1 mL、2 mL、5 mL和10 mL。由于有些农药遇光分解，因此还应有棕色玻璃瓶或用避光纸包装。农药标准物质在贮存和运输过程中应避免光照或包装不严与空气接触。一般贮于干燥器（最好充氮气）内，然后置于冰箱中（-18 ℃）。

有些农药纯品极易分解，有效期很短，如有机磷农药敌敌畏、氧乐果等，这类农药往往是现制备现用。对于稳定性好的农药即使过了有效期，可以重新定值使用。而且这种定值通常只需要检测有效成份含量。应该说明的是大多数农药在经过高度纯化后，会比在原药及制剂形式下更为稳定。新农药的纯品稳定性通常要经过2年时间的考察。

（6）使用及注意事项 标准物质即使在符合要求的贮藏条件下，量值也是会发生变化的，因此要十分注意证书上的有效期。更换新批次的标准物质要进行比对试验，证明性能符合要求后才能投入使用。从暗处低温取出标准物质应先置于常温干燥器中平衡，避免冷凝水对标准物质的影响。纯度标准物质称样量不宜少于5 mg。易挥发的液体农药，可采用先称量稀释剂，后加入农药标准物质的称量法。要特别注意稀释剂或内标物对农药标准物质稳定性的影响。配制的储备液浓度一般应为1 000 mg/L，从中间溶液到工作溶液要逐级稀释（1~2数量级），浓度跨度不宜过大。工作溶液要当天现用现配，不宜连续使用。要防止稀释溶剂在定量容器或进样瓶中的挥发。废弃的溶液标准物质不能随意弃掉，防止其对样品或其他物品的污染。

二  农药标准物质常用的制备方法

农药标准物质来源于农药纯品，农药纯品的制备是对有机化合物的分离和纯化的过程。如果需要制备的是一级标准物质则必须采用一种或多种制备方法进行高度纯化。如果制备工作标样，则可根据用途和分析测定方法来决定纯化的步骤和程度。

农药纯品的制备需要原料（候选物）。原料可以是农药原药（原粉或原油），纯度至少90 %以上。同时要对原药进行挑选，如色泽、不同部位等。在实验室内进行合成，也是获得高纯度原料的一种方法。这种合成需要使用纯化后的试剂及中间体，其原料纯度应达99 %以上。易光解、热解或稳定性差的农药更适合于实验室内合成。

下列纯化技术方法可以单独或联合采用。

（1）重结晶法 对于含少量杂质的农药原粉，最有效的纯化方法是选用适宜的溶剂进行重结晶，以分离除去杂质。

①重结晶原理。农药原药在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高，溶解度增大。如果把原药溶解在热的溶剂中并达到饱和，那么冷却时，由于溶解度降低，结晶析出。利用溶剂对样品和杂质的溶解度不同（样品溶解度在室温时比杂质的溶解度小），使样品从过饱和溶液中以结晶析出，而杂质则留在溶液里，从而达到了分离的目的。

②重结晶溶剂的选择。采用重结晶提纯农药能否成功，关键是选择合适的溶剂。常用的重结晶溶剂见表1。

表1 常用的重结晶溶剂

注：×— 表示不溶解或不易燃，√— 表示溶解或易燃的程度

③选用重结晶溶剂的原则。不与被纯化的农药发生化学反应；高温时能溶解较多农药，低温时只能溶解少量的农药；对杂质溶解度非常大（留在母液中），或溶解度非常小（以固态存在，过滤掉）；本身容易挥发易与结晶分离除去；如果该溶剂符合上述条件，取决于析出的晶型。

在提纯农药的过程中，如果不能选择到一种合适的溶剂时，常可使用混合溶剂获得满意效果。具体操作是先将待纯化的农药在接近溶剂（溶解度大）的沸点时溶解，若有不溶物，趁热过滤，若有颜色，则用活性炭煮沸脱色后再趁热过滤。然后在此热滤液中小心地加入热的不良溶剂（溶解度小），直至所呈现的浑浊不再消失，再加入少量良溶剂或稍加热使之恰好澄清。最后，冷至室温，析出结晶。有时也将两种溶剂预先混合好。常用的混合溶剂如下：乙醇—水，乙醚—甲醇，乙酸—水，乙醚—丙酮，丙酮—水，乙醚—石油醚，苯—石油醚。

④重结晶操作步骤。选择重结晶溶剂→加热溶解→趁热过滤→结晶析出→减压抽滤→干燥。

加热溶解回流：根据溶解度，称取适量的农药，加入回流瓶体积2/3的溶剂，脱色制备高温饱和溶液。回流时间一般30 min。

活性炭加法有两种：一是回流时加入到溶剂和农药样品一起回流；二是，待溶剂冷却至沸点以下时加入搅拌。活性炭加入量为1~5 %，太多对农药有吸附。必要时可两次脱色。

注意：防止溶剂着火和活性炭引起暴沸。

趁热过滤：整个过程要迅速，防止结晶析出时操作无法进行，可采用保温漏斗，往往也采用减压抽滤，过滤后的溶液应是澄清的。减压抽滤要防止活性炭被抽入到滤液中。过滤可以使活性炭、不溶物（化学杂质、机械杂质）与高温的饱和溶液分离。

结晶：将滤液静置，使其慢慢冷却。慢慢得到的晶体颗粒大而均匀，纯度高；迅速冷却并搅拌得到的晶体颗粒细而不均匀，纯度差。对不易析出结晶的过饱和溶液，可采用玻璃棒摩擦容器内壁或投入“晶种”的方法。通过结晶可得到农药纯品和初纯品。

抽滤：通常减压抽滤，使用玻璃砂芯漏斗。洗涤晶体时，最好用重结晶溶剂（最好事先低温贮藏），洗涤时应先停止抽气，再加洗涤溶剂，用玻璃棒小心搅拌，使所有晶体湿润，静置片刻，再抽气。如果用沸点高的重结晶溶剂，改用低沸点溶剂冲洗，低沸点的溶剂必须与高沸点溶剂互溶，且对纯化的农药溶解度低。抽滤的目的是晶体与溶液分离。

干燥：将晶体转移到表面皿或合适的容器上。干燥可分为3种方法，一是自然干燥：放在实验台面上，让溶剂自然挥发。但对在空气中吸湿的样品不能采取这种方法。二是烘干：对热稳定性好的农药，可在低于其熔点的温度下于烘箱中或红外线灯下烘干。三是真空干燥器中干燥，可加热，可减压，干燥彻底。干燥的目的是排除残存的重结晶溶剂或某些挥发性杂质。

干燥后的样品通常要研磨，贮存在合适的容器里或分装。然后放置在避光低温干燥场所。

重结晶法适用于下列常用农药品种的纯化：乐果、亚胺硫磷、甲基对硫磷、敌百虫、克百威、甲霜灵、百菌清、2甲4氯、甲草胺、氟乐灵、溴氰菊酯、抗蚜威等。

（2）蒸馏法  ①原理。将液体农药加热至沸腾，使液态变为气态，然后再使蒸汽冷却凝结为液体进到另一容器中去，这样两个过程联合操作称为蒸馏。纯的液体农药在一定压力下有固定的沸点。如果在蒸馏过程中，沸点发生变动，就说明有杂质流出。为了得到高纯农药，就必须进行馏分截割。

必须指出，具有固定沸点的液体不一定都是纯的物质，因为某些有机物常常和其它组分形成二元或三元共沸混合物，它们也有固定的沸点。大多数二元或三元共沸混合物，通常其共沸点要比任一单一组分的沸点都低。但也有例外，如20 %丙酮（56.2 ℃）和80 %氯仿（61.2 ℃）混合，其混合液的沸点变成了64.7 ℃。

液体的沸点随压力的不同而变化，所以分为常压蒸馏和减压蒸馏两种，农药纯品的制备采用减压蒸馏（图2）。 

图2 农药纯品制备的减压蒸馏装置

②操作步骤和注意事项。减压蒸馏装置主要由三部分组成。包括蒸馏、抽气以及在它们之间的保护和测压装置。

蒸馏部分由蒸馏瓶、冷凝器和接收瓶组成。蒸馏瓶采用两个颈的克氏蒸馏瓶，一个颈插温度计，另一个插一根毛细管，起到沸石防止暴沸作用。其他为普通冷凝器和接收瓶。

减压装置主要由真空泵、真空胶管、保护和测压装置组成。在保护系统中，要有安全瓶，主要用于调节系统压力及放气。封闭式压力计用于测量系统中的实际压力。三个吸收塔，第一个装无水氯化钙或硅胶用于吸水；第二个装粒状氢氧化钠，用于吸酸；第三个装石蜡片，可吸收烃类气体。普通旋片式真空泵达不到工作压力时，还应串联真空扩散泵。

减压蒸馏时，必须保证系统不漏气，各接口要涂好真空脂，不要用普通胶管代替真空胶管。

具体步骤：

一是加料。液体量不要超过克氏蒸馏瓶容积的一半，可防止暴沸或液体的飞沫被蒸汽带走。蒸馏瓶要有2/3浸入到浴液中。

二是减压检漏，调压。调整到需要的压力，如敌敌畏，0.1 Pa。减压蒸馏，采用磁力加热搅拌器是一种非常简便、高效的方法。

三是加热。100 ℃以下样品采用水浴，100~250 ℃油浴（甘油等），250 ℃以上砂浴。超过250 ℃时，不能采用玻璃蒸馏器。

四是沸腾。此时，温度计指示急剧上升。

五是蒸馏。开始时既不要快也不能太慢，控制速度为1~2滴／s。接前馏分，注意观察压力和温度的变化，当达到所需馏分沸点时，更换馏分瓶；当温度超过所需馏分沸点时，停止蒸馏。减压蒸馏法对在常压下蒸馏易分解或遇热易分解的样品非常有效。一般要进行2~3次重蒸馏，才能达到要求。

注意事项：温度计水银球的上限与蒸馏瓶支管下限在一水平面上，先搅拌、减压、后升温。

减压蒸馏法适用的农药品种：2,4-D丁酯、敌敌畏、稻瘟净、禾草丹等。

（3）柱层析法 柱层析法的特点是应用范围广（固体、液体都适宜），操作简便，分离效率高。

①基本原理。根据组分在固定相中的作用原理不同，柱层析可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析和排阻层析。农药纯化常用吸附层析和分配层析。

吸附层析根据固定相（吸附剂）对混合物中各组分的吸附能力不同实现分离和纯化。比如用硅胶作固定相，当混合物的溶液流经固定相时，混合物中各组分就被吸附在硅胶颗粒表面上。再用单一溶剂或混合溶剂作流动相淋洗该柱，由于硅胶对混合物中各组分的吸附性能不同，已被吸附在硅胶上的各组分就会以不同的速度解吸并重新回到溶剂中。随着溶剂的向前移动，已解吸的各组份遇到新的吸附剂就又再一次以不等的吸附力被吸附，当新的流动相流过时，它们就又一次解吸进入流动相并向前移动。如此在层析柱上不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸，使混合物中各组分在吸附剂表面上表现出的吸附能力的微小差异，经多次重复积累而成为大的差异。结果吸附力小的组分先从柱中流出，吸附力大的组分后从柱中流出，从而达到分离的目的。

分配层析与吸附层析的不同之处是混合物中各组分的分离是根据其在两相中的分配系数的差异来实现的。吸附层析实质属于液—固色谱范畴，而分配层析属于液—液色谱范畴。

②操作的基本步骤。

一是选择层析柱（长度和口径之比10:1为宜），碱式滴定管可当层析柱来使用。

二是选择吸附剂。要求：不溶于选用的淋洗液；不与淋洗液和分离组分起化学反应，也不起催化作用；无色，粒度均匀，细度合适。常用有硅胶、氧化铝、弗罗里硅土等。

一般分离极性强的物质，选用吸附力小的吸附剂；分离极性弱的物质，应选用吸附力强的吸附剂。

三是填装吸附剂。要求均匀紧密一致。填装有干法和湿法两种。干法不容易填装均匀，湿法容易装好层析柱，湿法是称取适量的吸附剂，一般为分离样品重量的50倍加入溶剂调和，调好后倒入柱中，使其慢慢沉降。

四是选择淋洗剂。可采用薄层色谱的方法选出理想的淋洗液。选择原则：分离极性强的农药，选用吸附能力较弱的吸附剂和极性较强的溶剂作淋洗液；分离极性弱的农药，宜选用吸附能力较强的吸附剂和极性较弱的溶剂作淋洗液；在单一溶剂作为淋洗液不理想时，可加入一些极性更强或更弱的溶剂来调节淋洗液的极性，以达到最佳分离效果。

五是洗柱。除去柱中的残留空气，使柱更紧密均匀，保持柱顶不干。

六是加样。待洗柱时的淋洗液离柱填料平面1 mm左右，加入待分离的组分。滴加淋洗液，流速1滴/s，或1滴/4s。在操作过程中，防止柱顶端进入空气，不要让柱填料裸露在空气中。

七是洗脱。根据分离情况，切割收集各组分，进行鉴定，找到纯度高的馏分，然后蒸馏干燥得到农药纯品。

柱层析适用于杀草丹、丁草胺、2,4-D丁酯等农药品种的纯化。

（4）区熔提纯法（区域熔融法） 根据被提纯农药中各组分在相变中重分布的原理，从而得到较纯组分的提纯方法。杂质一般使纯物质的熔点降低，随着熔区的移动，能使杂质一起移动，而富集于一端，纯物质则向相反的方向移动而富集于另一端。该方法设备简单，提纯效率高，操作可自动化，应用范围广。一般操作先卧式提六次，再立式提一次。本方法适用于六六六4种异构体等农药的提纯。

（5）升华法 所谓升华就是指物质不经过液态而直接从固态转变为气态的现象，这样的农药必须具有相当高的蒸汽压。升华法有常压和减压两种方法。可以升华的农药品种有：硫磺、六六六、氯化乙基汞、磷化铝等。升华法在农药纯品制备中应用较少。

（6）色谱制备法 常用的薄层色谱也可以制备农药纯品，但获得量仅为毫克级。利用制备色谱仪或半制备色谱仪纯化农药，可获得克级水平纯品。该方法适于商品化生产。目前液相制备色谱仪应用较多，缺点是分离后往往需要重新蒸馏。色谱法制备农药标准物质应是主要发展方向，它的前期研究工作虽然投入大，但后期高效、安全、经济、环保、纯度高，可以按需定产的优势十分明显。

三  农药标准物质常用的鉴定方法

对于制备的农药纯品样品，还要通过定性鉴定和定量分析，综合考虑各种因素对测量结果的影响，确定该农药纯品是否达到农药标准物质的技术要求。农药标准物质的定性通常要采用三种不同的方法进行检验，方法中至少应包括一种物理化学方法和一种色谱方法。定性检验的目的是明确农药在提纯过程中是否发生了化学变化，或者纯度能否达到一级标准物质的要求。定性检验应先于定量检验。清楚定性检验结果后，才能决定是否对被提纯农药进行准确定值。

农药标准物质的定值至关重要，对于一级标准物质必须采用绝对测量方法，二级标准物质可用一级标准物质直接对比测量。农药标准物质的定值通常要采用二种不同原理的方法定值。

常用的农药标准物质定性方法有：

（1）物理常数的测定 采用的测定方法应为经典的或国际、国家标准中承认的有效方法，不采用上述方法，所测数据则没有可靠性、可比性。

①熔点测定。对固体农药纯品定性鉴定测定熔点是一种方便和可靠的方法。每种农药纯品都有其固定的熔点（见表2）。

对于纯化后的农药，其熔程越窄说明纯度越高，质量越好。熔点100 ℃以下的农药通常熔程应＜0.5 ℃。

表2  10种农药纯品的熔点

②沸点的测定。对液体农药纯品可以通过测定其沸点来定性。常压测定时农药通常会分解。几乎所有农药的沸点都是在减压的情况下测定，因此实际测定不方便。常见农药的沸点见表3。沸程与农药的纯度也有密切关系，一般沸程差应为0.5~1 ℃。   

表3  10种农药纯品的沸点

③溶解度的测定。各种农药纯品在不同溶剂中的溶解度可从文献中查出。溶解后的溶液应该完全澄清。

④其它物理常数的测定。农药纯品的相对密度、折光系数、蒸汽压等也是同样重要的检验项目，所测值应与文献记载数据一致。

（2）光谱法定性  ①紫外吸收光谱法。利用农药分子吸收紫外光的特性，对农药纯品进行定性或结构分析的方法。虽然紫外光谱图提供的信息较简单，但是也能够反映出农药分子中是否存在双键、芳烃、共轭体系，其中吸收曲线、最大吸收峰、摩尔吸光系数都是很重要的定性指标。所用的测定方法、溶剂对紫外吸收曲线有很大影响，产生蓝移或红移。

②红外吸收光谱法。利用农药分子对红外光吸收的特性，分析农药分子结构的一种方法。能够快速测定农药分子的骨架和官能团。有标准的红外吸收光谱图库供检索，提纯后的农药红外吸收光谱图应与标准谱图一致。

③核磁共振波谱法。通过测定磁性原子核在外加磁场中与射频电磁波照射下的共振信号，做出核磁共振图谱，用以分析鉴定农药分子的组成和结构的方法。通常能精确地测定农药分子的微细结构。特别适合于光学异构体结构鉴定。

（3）色谱法定性 色谱法定性的依据是R_f值、相对保留时间、相对保留指数。要求农药纯品与农药标准物质的相对保留值应一致或在允许范围内。色谱法的另一优点还可以筛分农药纯品中的杂质。

①薄层色谱法。该方法为经典的方法，文献量较大，易于查找和应用。通常选用合适的吸附剂和显色条件后，采用二种展开剂展开，应显现出单一斑点，原点无残存物。在条件一致的情况下，农药的R_f值是定性的重要依据。

②气相色谱法。气相色谱法适合于大多数农药品种的定性分析。要求用两种不同极性色谱柱，农药纯品与标准物质的相对（绝对）保留时间一致或在允许范围内。顶空气相色谱法适用于残存在农药纯品中溶剂的定量分析。

③液相色谱法。对分子量较大、热稳定性差、极性较强的农药非常适用。要求用两种不同的流动相，农药纯品与标准物质的相对（绝对）保留时间一致或在允许范围内。

（4）质谱法 现多采用气质或液质联用（单极或串联）的分析方法。一次分析即可通过总离子流图获得农药纯品及所含杂质的种类和面积归一化的信息。色质联用定性不仅仅是根据相对保留时间，更重要的是同时可以获得农药纯品的相对分子质量，特征离子碎片。采用不同的离子化方式，农药的各种离子碎片有其特征和规律性。

（5）互联网谱图资源的利用 互联网上有可以利用的农药定性鉴别的资源。中科院上海有机化学研究所的化学数据库（http://202.127.145.134/scdb），有红外、质谱谱图等信息；日本有机化合物光谱数据库（SDBS，http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng）（WIN10系统需要IE打开）有红外、拉曼、核磁共振、质谱谱图等信息；美国国家标准与技术研究院化学数据库（NIST，http://webbook.nist.gov/chemistry）有紫外、红外、拉曼、质谱谱图等信息。但是，这些数据库中通常不提供具有重要商业价值和新近开发上市的农药品种相关谱图。

常用的农药标准物质定值方法有：

（1）绝对测量法

①差示扫描量热法（DSC）。属于一种热量分析技术。该方法是在程序控制温度下，测量输出物质与参比物的功率差与温度关系的一种技术。当试样发生任何物理或化学变化时，所释放或吸收的热量使样品温度高于或低于参比物的温度，从而相应地在差热曲线上可得到放热或吸热峰。差示扫描量热法具有快速、精确，试样用量少的优点，可测定农药的绝对纯度。DSC测定纯度是根据熔点或凝固点下降来确定杂质含量的，基本原理依据Van't Hoff方程。

②相溶解度分析法。当一种农药纯品在某一种溶剂中饱和时，其杂质不会饱和，根据其溶解杂质增量的变化，计算出农药纯品中杂质含量的方法。相溶解度法要求测量仪器精确可靠，能够重现。

③容量分析法。可采用经典的化学容量滴定分析方法，如银量法、碘量法对农药纯品定值，但是这种方法应用有很大的局限性，它要求被测定农药要有特征的、无副反应的化学反应。

（2）相对测量法

①气相色谱法。目前广泛应用的定值方法之一，快速简便，面积归一法假设的前提是检测器对各组分的响应因子均为1，但实际情况可能是检测器对有些杂质没响应或响应因子不等于1，对定值结果的准确性有一定影响。这种影响可通过其他定值方法加以校正。

②高效液相色谱法。对于一种农药纯品的面积归一化定值，如果在紫外检测器有响应，最好在采用气相色谱法面积归一定值后，再采用高效液相色谱法定值，综合考虑给出该农药纯品的纯度值。

③元素分析法。各种农药纯品依据其分子式，可计算出各种元素所占的比例，依此来分析判断该种农药的纯度。如除草醚的分子式为C₁₂H₇Cl₂NO₃，其中Cl占24.96 %，N占4.93 %，H占2.48 %，C占50.73 %。

纯度值的统计分析与给定。农药纯品在均匀性检验（包括瓶间、瓶内测定）的基础上，应给出纯度值。对一种农药纯品通常要采用3种以上的测定方法定值，每种方法测得5~8个值。对于一级标准物质至少有20个以上测定值。这些数据可参照JJF1343进行统计分析。综合考虑各个影响定值的因素，给出每次测定的总平均值。在有些情况下，定值也采用从100 %中减去杂质的做法，如减去水分、灰分、溶剂、酸度等杂质，然后给出最终的纯度值。

四  农药标准物质制备和鉴定的实例

在常温下，大多数农药以固态或液态两种形式存在，现以抗蚜威、敌敌畏两种杀虫剂为例，具体介绍其纯化、鉴定和定值的方法。

（1）抗蚜威（pirimicarb）

化学名称：2-N,N-二甲基氨基-5,6-二甲基嘧啶-4-N,N-二甲基氨基甲酸酯(CAS No.23103-98-2)。

结构式：

分子式：C₁₁H₁₈N₄O₂

相对分子质量：238.3

理化性质：纯品为无色无味结晶体，熔点90.5℃，30℃时蒸汽压为4×10^-3Pa，25 ℃水中溶解度0.27 g/100 mL，溶于大多数有机溶剂，易溶于醇、酮、酯、芳烃、氯代烷烃。在一般条件下比较稳定，但遇到强酸或强碱，或在酸碱中煮沸则分解，水溶液见光易分解，无腐蚀性。

①     提纯。

方法提要：样品用活性炭脱色后，在异丙醇中重结晶。

试剂：抗蚜威原药、石油醚（60~90 ℃）、活性炭（分析纯）、异丙醇。

仪器：烧杯、搅拌器、布氏抽滤装置、滤纸、锥形瓶、结晶皿、电热板、烘箱、研钵。

操作步骤：用足够量的石油醚制备抗蚜威原药的悬浮液，在室温下搅拌5 min后，布氏漏斗抽滤，弃掉石油醚。将布氏漏斗中的固体物转移至烧杯中，加入少量异丙醇，保持电热板的温度，使溶液不超过65 ℃，制备抗蚜威热饱和溶液。以2 g/100 mL的量加入脱色活性炭，加入活性炭时要防止暴沸。边加边搅拌，在65 ℃条件下搅拌10 min，然后趁热过滤，将滤液转入锥形瓶中，室温下放置过夜。用玻璃砂芯漏斗过滤结晶，（必要时再重结晶一次，但不加活性炭）将结晶体转移放在结晶皿内，于65 ℃烘箱内彻底干燥。将干燥后的结晶置于研钵内研磨成均匀的粉末，贮存在密闭的玻璃瓶中。

②定性鉴定。

熔点。采用CIPAC MT2方法测定。抗蚜威 mp.90.5 ℃。

薄层色谱。基本测定条件参见CIPAC MT164。用下列条件检验纯品中的杂质。

硅胶GF₂₅₄，板厚0.25 mm，展开剂：二氯甲烷:丙酮=90:10（V/V），点样量：10 %的抗蚜威三氯甲烷溶液，10 μL和50 μL两个点。R_f值：0.54，显色为UV 254 nm。在硅胶板上50 μL点样量应显示单一斑点，并且原点不显示出残留物。如可观察到杂质应继续重结晶。

抗蚜威的红外吸收光谱图（溴化钾压片）如下： 

        抗蚜威的¹H-NMR波谱图如下： 

        抗蚜威的¹³C-NMR波谱图如下： 

       抗蚜威质谱图(EI)如下：

③定值：  

溶剂含量。采用气相色谱法，测定残存的异丙醇。

色谱柱：玻璃填充柱1.8 m×4 mm内径，内装10 % SE 30/Chromosorb W-HP 125~149 mm(100~120目)或等效者；

检测器：FID；

温度：柱温：初温80 ℃，保持2 min，升温速率16 ℃/min，终温230 ℃；

气化室：220 ℃；检测室：250 ℃；

进样：采用SGE固体进样器。

正式分析样品前，先进一针空气，验证有无干扰峰的存在。然后取适量的固体样品进样，用面积归一化法确定溶剂所占的百分含量。

灰分含量测定。用5 g的样品，按照CIPAC1A  MT29的方法测定。

水分含量的测定。用1 g的样品，按照CIPAC1A  MT30.1的方法测定。

采用毛细管气相色谱法测定抗蚜威纯度：

色谱柱：12 m长，涂OV-73；

检测器：FID；

温度：柱箱：初温60 ℃，保持1 min，一阶升温速率20 ℃/min，一阶终温125 ℃，保持5 min；二阶升温速率30 ℃/min，二阶终温270 ℃。气化室：250 ℃。检测室：300 ℃；

气体流速：载气：H₂ 2 mL/min(125 ℃)；尾吹气：N₂ 2 mL/min(125 ℃)；燃气：H₂ 30 mL/min(125 ℃)；助燃气：空气 450 mL/min；吹扫气：N₂ 4 mL/min；不分流；

进样量：1 μL（进样浓度为55 mg/25 mL正己烷）。

扣除掉正己烷色谱峰面积值，用面积归一化法计算抗蚜威的含量。至少要称4~8个样品，进样分析，符合要求后计算出平均值，减去溶剂含量、灰分含量、水分含量后即为抗蚜威纯度值。

（2）敌敌畏（dichlorvos）

化学名称：O,O-二甲基-O-（2,2-二氯乙烯基）磷酸酯（CAS No.62-73-7）

结构式：

分子式：C₄H₇Cl₂O₄P

分子量：221.0

理化性质：纯品为无色油状液体，略带芳香气味。挥发性强。沸点74 ℃（133 Pa），蒸汽压1.60 Pa (20 ℃)，相对密度1.4(20 ℃)，挥发度145.0 mg/m³(20 ℃)，折光系数 1.45。在室温下水中的溶解度为1 g/100 mL，易溶于大多数有机溶剂。对热稳定。在酸性介质和水中缓慢分解，在碱性条件下迅速降解。对铁有一定的腐蚀性。

①提纯。

方法提要：将敌敌畏原油在以乙二醇做固定相、耐火砖为载体的色谱柱进行分离，进一步纯化采用减压蒸馏的方法。

试剂：敌敌畏原油、乙二醇（分析纯）、石油醚（30~60 ℃，分析纯）、四氯化碳（分析纯）、二乙醚（分析纯）、无水硫酸钠、耐火砖 250~355 μm（40~60目）：先用蒸馏水彻底洗干净，然后用丙酮清洗，过滤待溶剂挥发后，在105 ℃条件下干燥，用分级筛截取250~355 μm粒度的耐火砖材料。

仪器：厚壁玻璃管色谱柱，规格2.5 m×50 mm、旋转蒸发器、100 mL馏分收集器、抽气泵：适合于石油醚-四氯化碳混合溶剂（3:2，V/V），压力为100 kPa，排气量为6 L/h、减压蒸馏装置：0.1 Pa，70 ℃条件下工作，蒸馏瓶（100 mL），具有10 cm长的维格罗分馏柱，20 cm冷凝器，尾端装有3分头的馏分收集器（图3）。 

图3 制备型液相色谱装置

操作步骤：向装入2.5 kg的耐火砖聚乙烯（大约厚0.1 mm）袋中加入2.5 kg的乙二醇，反复颠倒混合均匀。每次取50 g填料装入色谱柱中，轻轻地填实。倒入石油醚-四氯化碳混合液（用乙二醇饱和）5.5 L排除柱中的气体，然后用合适的进样环在柱顶部加入80 mL敌敌畏原油。以6 L/h的流速用石油醚-四氯化碳混合溶剂淋洗色谱柱，放弃前2 L淋洗液，用100 mL分馏瓶，收集后6 L淋洗液用气相色谱法测定这些馏分，通常只有在25~55号馏分瓶中有敌敌畏。用旋转浓缩器蒸掉淋洗液，用400 mL二乙醚溶解剩余溶液，先后2次各用300 mL水清洗二乙醚层，然后用旋转浓缩器浓缩除掉二乙醚。减压蒸馏敌敌畏，收集0.1 Pa（55~60 ℃）条件下无色液体。收率可达50 %。

②定性鉴定。

薄层色谱：硅胶GF₂₅₄板，紫外灯254 nm显色，展开剂：二氯甲烷:丙酮= 4:1（V/V）。点样浓度为100 g/L丙酮溶液，点样5 μL，展开后应为单点。

敌敌畏的红外吸收光谱图（涂膜）如下：

敌敌畏的¹H-NMR波谱图如下：

敌敌畏的¹³C-NMR波谱图如下：

敌敌畏质谱图(EI)如下：

③定值。水分含量。按照CIPAC  MT 30.1方法测定，含水量<0.02 % (m/m)。

酸度含量测定。按照CIPAC  MT 31方法，含量以H₂SO₄计，<0.02 % (m/m)。

气相色谱归一化法。

色谱柱：柱长1.5 m×4 mm内径，内装3 % Reoplex 100/Gas Chrom Q 74 mm~149 mm(100~200目) 或等效者；

检测器：FID；

柱箱温度：初温100 ℃，保持2 min，升温速率4 ℃/min，终温 200 ℃；

载气：N₂ 60 mL/min；

进样量：0.1 μL敌敌畏纯品；

保留时间：约12 min。

用面积归一化法计算敌敌畏的含量。至少要称4~8个样品进样分析，符合要求后计算出平均值，减去水分，酸度含量即为敌敌畏的纯度值。